Современные методы санитарно микробиологических исследований. Бактерии группы кишечных палочек. Методы санитарно-микробиологических исследований. Микрофлора окружающей среды

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно состояние почвы – совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень её безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении. Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от её глубины. В поверхностном слое почвы (0 – 10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажностью почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10 - 30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд. клеток на 1 г почвы), наимеее - почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн. клеток в 1 г). Оценка санитарного состояния почвы проводится по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые.

Косвенные показатели характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм Clostridium perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы – обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогеннные энтеробактерии, энтеровирусы). Результаты анализов оцениваются в соответствии с таблицей «Оценка степени эпидемической опасности почвы».

Оценка степени эпидемической опасности почвы

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности её к самоочищению исследуют показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы, актиномицеты, аммонификаторы.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-46 0 С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 37 0 С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 0 С в течение 24 часов.

Питьевой воды

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсеменённости разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путём посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчёт микробного числа по формуле:

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи пищевых продуктов.

Первым принципом является правильное взятие проб для санитарно-микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, и правил стерильности. Ошибки, допущенные при взятии проб, приводят к получению неправильных результатов, и исправить их уже нельзя. При упаковке и транспортировке проб необходимо создавать такие условия, чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры в исследуемом объекте, что может исказить результаты исследований. Поэтому одним из правил является, возможно, быстрое проведение исследований, и, если необходимо, сохранение материала только в условиях холодильника и не более 6-8 часов. Каждая проба сопровождается документом, в котором указывают название исследуемого материала, номер пробы, время, место взятия, характеристика объекта, подпись лица, взявшего пробу.

Второй принцип – проведение серийных анализов исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно. К тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала – среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип – повторное взятие проб – необходимо для получения сопоставимых результатов. Это связано, прежде всего, с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, да и распределяются в ней равномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды.

Четвертый принцип – применение стандартных и унифицированных методов, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность получить сравнимые результаты.

Пятый принцип – использование при оценке исследуемых объектов одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный - позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно-показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование как бы обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно-микробиологических исследований.

Шестой принцип – заключается в проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т.д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловливаются посторонними микроорганизмами. Санитарный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящих в норме и в исследуемом объекте (сырье, пищевые продукты, готовом изделии и т.д.), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению. Нередко врачу приходится прибегать к помощи специалистов в области общей, сельскохозяйственной, промышленной, ветеринарной микробиологии и решать вопрос при непосредственном участии соответствующих специалистов.

Седьмой принцип – ответственность врачей санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарно-микробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Если пищевые продукты возможно реализовать, врач должен дать обоснованную рекомендацию о наиболее рациональном способе их обработки и употреблении. Запрещается использовать пищевые продукты, воду водоемов и др. Закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносит определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы. Для большей объективности в оценке полученных результатов и заключениях врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством Здравоохранения. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

При проведении санитарно-микробиологических иссле­дований необходимо выполнять следующие требования.

1. Правильный отбор проб

Его проводят с соблюдением всех необходимых правил асептики; при хранении и транспортировке необходимо ис­ключить возможность гибели и дополнительного размноже­ния микроорганизмов. При невозможности немедленно сде­лать анализ материал хранят не более 6-8 часов.

2. Серийность проводимых анализов

Микроорганизмы в объектах окружающей среды распре­делены крайне неравномерно. Для получения адекватных ре­зультатов проводят отбор серии проб из разных участков объ­екта. При проведении анализов все образцы смешивают и от­бирают среднюю пробу.

3. Повторность отбора проб

Для получения сопоставимых результатов осуществляют повторный отбор проб в связи с тем, что в исследуемых образ­цах состав микробиоты меняется достаточно быстро.

4. Применение стандартных методов исследования

Использование методик, утвержденных ГОСТ, позволяет получать в разных лабораториях сопоставимые результаты.

5. Использование комплекса тестов

Необходимо для получения адекватной информации при сочетании прямых и косвенных методов выявления микроор­ганизмов с учетом влияния факторов внешней среды и собст­венной микробиоты объекта.

Микробиологические основы ХАССП...

Глава 4. Источники и пути микробной контаминации.

Современная санитарная микробиология стремится ис­пользовать простые, точные и надежные методы. Они направ­лены на определение общей микробной загрязненности, вы­явления СПМ и включают:

Прямой подсчет при микроскопии микроорганизмов в объекте;

Методы выделения и идентификации микроорганиз­мов;

■- биологические методы с использованием лабораторных животных.

Прямой подсчет применяют в экстренных случаях при необходимости срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др.). Основной недостаток - невозможность получить точный ответ из-за образования бактериями агломератов или прикре­пления к частицам среды. Метод не позволяет отличать жи­вые бактерии от погибших.

Посев на питательные среды производят для количест­венного подсчета. На плотных питательных средах подсчиты­вают число выросших колоний. При этом исходят из предпо­ложения, что каждая колония является результатом попада­ния на среду одной жизнеспособной клетки. Данный метод неточен, так как выявляет только группы микроорганизмов, растущих на определенных питательных средах при опреде­ленной температуре. Невозможно создать унифицированную, подходящую для всех микроорганизмов среду. Не все микро­организмы, находящиеся в объекте, дают колонии на пита­тельной среде из-за конкуренции и антагонизма.

Содержание числа живых клеток в объекте отражает по­казатель количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ), которое определя­ется путем подсчета колоний, выросших в агаризованной сре­де в чашках Петри при температуре 30±1°С в течение 3 дней (72±3). Это определение регламентировано Международной организацией по стандартизации методов микробиологиче­ского анализа (International Standart Organisation, ISO) и ГОСТ 10444.15-94. КМАФАМ выражается в колониеобразую-щих единицах (КОЕ) и рассчитывается на 1 г (см 3) образца.

Термин КМАФАМ КОЕ/г (см 3) наиболее полно характе­ризует определяемую принятыми методами группу микроор­ганизмов, поэтому в настоящее время его используют вместо обозначений, применявшихся ранее (общее количество бакте­рий, количество сапротрофов, гетеротрофов в 1 г (см 3), общее микробное число).

Микробиологические показатели безопасности пищевых продуктов для большинства групп микроорганизмов оцени­вают по альтернативному принципу, то есть нормируется мас­са продукта, в которой не допускается присутствие опреде­ленных видов микроорганизмов.

Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи пищевых продуктов.

Первым принципом является правильное взятие проб для санитарно-микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, и правил стерильности. Ошибки, допущенные при взятии проб, приводят к получению неправильных результатов, и исправить их уже нельзя. При упаковке и транспортировке проб необходимо создавать такие условия, чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры в исследуемом объекте, что может исказить результаты исследований. Поэтому одним из правил является, возможно, быстрое проведение исследований, и, если необходимо, сохранение материала только в условиях холодильника и не более 6-8 часов. Каждая проба сопровождается документом, в котором указывают название исследуемого материала, номер пробы, время, место взятия, характеристика объекта, подпись лица, взявшего пробу.

Второй принцип – проведение серийных анализов исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно. К тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала – среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип – повторное взятие проб – необходимо для получения сопоставимых результатов. Это связано, прежде всего, с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, да и распределяются в ней равномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды.

Четвертый принцип – применение стандартных и унифицированных методов, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность получить сравнимые результаты.

Пятый принцип – использование при оценке исследуемых объектов одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный - позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно-показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование как бы обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно-микробиологических исследований.

Шестой принцип – заключается в проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т.д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловливаются посторонними микроорганизмами. Санитарный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящих в норме и в исследуемом объекте (сырье, пищевые продукты, готовом изделии и т.д.), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению. Нередко врачу приходится прибегать к помощи специалистов в области общей, сельскохозяйственной, промышленной, ветеринарной микробиологии и решать вопрос при непосредственном участии соответствующих специалистов.

Седьмой принцип – ответственность врачей санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарно-микробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Если пищевые продукты возможно реализовать, врач должен дать обоснованную рекомендацию о наиболее рациональном способе их обработки и употреблении. Запрещается использовать пищевые продукты, воду водоемов и др. Закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносит определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы. Для большей объективности в оценке полученных результатов и заключениях врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством Здравоохранения. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте-
рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 43 0 С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 43 0 С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 43 0 С).

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=37 0 С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-46 0 С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 37 0 С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 37 0 С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 0 С в течение 24 часов.

(согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)

Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 0 С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 0 С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа , делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный , если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы.

Самостоятельная работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ.

2. Выделение чистой культуры анаэробов (4–й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта–Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте.

3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном.